2019年12月，在中国中部有1100万人口的城市武汉，出现了一种由先前未知的病原体引起的新型肺炎。这些最初的病例与武汉市的一家海鲜市场的暴露有关。截至2020年1月27日，中国当局在中国大陆报道了2835例确诊病例，包括81例死亡。此外，在中国香港、中国澳门和中国台湾发现了19例确诊病例，在泰国、日本、韩国、美国、越南、新加坡、尼泊尔、法国、澳大利亚和加拿大发现了39例输入性病例。这种病原体很快被鉴定为一种新型冠状病毒（2019-nCoV），与严重急性呼吸综合征（SARS）冠状病毒（SARS-CoV）存在密切的亲缘关系。目前，尚无针对这种新病毒的特异性治疗方法。因此，迫切需要找到有效的抗病毒药物来对抗这种疾病。
 
一种有效的药物发现方法是测试现有的抗病毒药物是否有效地治疗相关的病毒感染。2019-nCoV属于β冠状病毒，SARS-CoV和中东呼吸综合征（MERS）冠状病毒（MERS-CoV）也属于β冠状病毒。一些药物，如利巴韦林（ribavirin）、干扰素、洛匹那韦-利托那韦（lopinavir-ritonavir）和皮质类固醇，已被用于SARS患者或MERS患者身上，不过其中的一些药物的疗效仍有争议。
 
在一项新的研究中，来自中国科学院武汉病毒研究所和北京药理毒理研究所的研究人员在体外评估了5种受到FDA（美国食品药物管理局）批准的药物---利巴韦林、喷昔洛韦（penciclovir）、硝唑尼特（nitazoxanide）、萘莫司他（nafamostat）、氯喹（chloroquine）---和两种已知的广谱抗病毒药物瑞德西韦（remdesivir, GS-5734）和法匹拉韦（favipiravir, T-705）对2019-nCoV临床分离株的抗病毒效果。相关研究结果于2020年2月4日发表在Cell Research期刊上，论文标题为“Remdesivir and chloroquine effectively inhibit the recently emerged novel coronavirus (2019-nCoV) in vitro”。
 
 
这些研究人员采用标准测定方法来测量这些化合物对2019-nCoV的细胞毒性、病毒产量和感染率的影响。首先，通过CCK8测定方法确定这些化合物在Vero E6细胞（ATCC-1586）中的细胞毒性。接着，在不同浓度的受试药物存在下，用nCoV-2019BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019（即前面提及的2019-nCoV临床分离株）在感染复数（multiplicity of infection, MOI）为0.05的情形下感染Vero E6细胞。二甲基亚砜（DMSO）用于对照组中。
 
通过定量实时RT-PCR（qRT-PCR）定量测定了细胞上清液中的病毒拷贝数来评估疗效，并在感染后48小时通过免疫荧光显微镜可视化观察病毒核蛋白（NP）的表达进行确认（细胞病变效应在病毒感染的这个时间点上效果并不明显）。在这7种受试药物中，高浓度的三种核苷类似物---利巴韦林（半数最大有效浓度（EC50）=109.50 μM，半细胞毒性浓度（CC50）>400 μM，选择性指数（SI）> 3.65），喷昔洛韦（EC50=95.96 μM，CC50> 400 μM，SI > 4.17）和法匹拉韦（EC50 = 61.88 μM，CC50 > 400 μM，SI> 6.46）---是降低病毒感染所需要的（图1a）。然而，尽管法匹拉韦已显示出100%有效保护小鼠免受埃博拉病毒攻击，但是它在Vero E6细胞中的EC50值高达67 μM，因此建议开展进一步的体内研究以评估这种抗病毒核苷类似物。
 
萘莫司他是一种有效的MERS-CoV抑制剂，可阻止膜融合，可抑制2019-nCoV感染（EC50 = 22.50 μM，CC50 > 100 μM，SI> 4.44）。硝唑尼特是一种抗原虫剂，在商业上有潜力抵抗包括人类和动物冠状病毒在内的多种病毒，它在低微摩尔浓度下抑制2019-nCoV（EC50 = 2.12 μM，CC50 > 35.53 μM，SI> 16.76）。建议对这种药物抵抗2019-nCoV感染的效果开展进一步的体内评估。值得注意的是，两种化合物瑞德西韦（EC50 = 0.77 μM，CC50 > 100 μM，SI>129.87）和氯喹（EC50 = 1.13 μM，CC50> 100μM，SI > 88.50）在低微摩尔浓度下有效地阻断了这种病毒感染并显示出较高的SI（图1a，b）。
 
在细胞培养物、小鼠和非人灵长类动物模型中，瑞德西韦最近被认为是一种有前景的抵抗多种RNA病毒（包括SARS-CoV和MERS-CoV）的抗病毒药物。它当前正用于治疗埃博拉病毒感染的临床开发中。瑞德西韦是一种腺苷类似物，可整合到新生病毒RNA链中并导致RNA链过早终止。 
 
时间过程分析（time-of-addition assay）表明瑞德西韦在病毒进入后阶段起作用（图1c，d），这与它作为一种核苷酸类似物的推定抗病毒机制相符合。Warren等人发现在非人灵长类动物模型中，静脉注射10 mg/kg剂量的瑞德西韦可导致它的活性形式在血液中持续存在（10 μM），并100％抵抗埃博拉病毒感染。这项研究的数据表明，瑞德西韦抵抗Vero E6细胞中2019-nCoV的EC90值为1.76 μM，这提示着它的工作浓度可能在非人灵长类动物中实现。这些初步数据表明瑞德西韦也在对人2019-nCoV敏感的细胞系（人肝癌细胞Huh-7）中有效地抑制病毒感染。
 
氯喹是一种广泛使用的抗疟疾和自身免疫疾病药物。最近报道它是一种潜在的广谱抗病毒药物。已知氯喹阻断病毒感染的机制是增加病毒/细胞融合所需的内体pH，以及干扰SARS-CoV的细胞受体的糖基化。这项研究的时间过程分析表明在Vero E6细胞中，氯喹在2019-nCoV的细胞进入阶段和细胞进入后阶段均起作用（图1c，d）。除了抗病毒活性外，氯喹还具有免疫调节活性，因而可能在体内协同增强它的抗病毒作用。在口服后，氯喹广泛分布于整个身体，包括肺部。氯喹对Vero E6细胞中2019-nCoV的EC90值为6.90 μM，这一数值在给予500 mg氯喹的类风湿性关节炎患者的血浆中被证实是临床上可实现的。氯喹是一种便宜且安全的药物，已被使用了70多年，因此，它可能在临床上可用于抵抗2019-nCoV。
 
这些研究发现表明，瑞德西韦和氯喹在体外控制2019-nCoV感染方面非常有效。鉴于这两种化合物可安全地用于人类患者，并且显示出对多种疾病有效，因此，这些研究人员建议应当在患有这种新型冠状病毒疾病的人类患者中对它们进行评估。
参考资料：
 
Manli Wang et al. Remdesivir and chloroquine effectively inhibit the recently emerged novel coronavirus (2019-nCoV) in vitro. Cell Research, 2020, doi:10.1038/s41422-020-0282-0.