作者:北京协和医院检验科博士后 马晓丽
 
近年来,液相色谱串联质谱技术(LC-MS/MS)在临床检验领域受到广泛关注。该技术具有特异度高、可同时区分定量多种代谢物等特点,正逐渐从科研应用走向临床实践前沿。
 
北京协和医院检验科邱玲团队自2012年开始筹建临床质谱实验室,至今已开展儿茶酚胺及其代谢物、25种类固醇激素、极长链脂肪酸等近五十项临床检测项目,对嗜铬细胞瘤及副神经节瘤、先天性肾上腺皮质增生、肾上腺脑白质营养不良等疾病的诊断及鉴别诊断提供了巨大帮助。
 
近期,邱玲团队禹松林等人在国际上首次开发出基于LC-MS/MS技术测定胃泌素G34和G17两种亚型的方法,并发表于国际临床化学检验Top1期刊《Clinical Chemistry》(https://doi.org/10.1093/clinchem/hvab097):
 
题目:Analytical and Clinical Performance of a Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry Method for Measuring Gastrin Subtypes G34 and G17 in Serum;
 
作者:Songlin Yu(禹松林), Danchen Wang(王丹晨), Xiaoli Ma(马晓丽), Yuanyuan Zhang(张元媛), Dandan Sun(孙丹丹), Yutong Zou(邹雨桐), Jialei Yu(于佳磊), Fang Zhang(张芳), Guohua Yang(杨国华), Shaowei Xie(谢少伟), Qian Cheng(程倩),Xinqi Cheng(程歆琦)(因出版方排版错误遗漏,勘误中将更正), Ling Qiu(邱玲)
 
LC-MS/MS在多种小分子代谢物的精准检测中被认为是金标准的方法,而近年来越来越多的研究开始将其应用于多肽及蛋白的定量分析。
 
本研究中的胃泌素是一种重要的多肽类胃肠激素,大部分胃泌素是由内分泌细胞(G细胞)分泌,主要成分有两种:G17和G34(根据其含有氨基酸的数量命名)。然而常规免疫测定方法仅能检测总胃泌素或单独检测G17。本研究旨在建立液相色谱串联质谱法(LC–MS/MS)同时测定血清G17和G34。
 
本方法采用阴离子交换固相萃取法制备血清样本。并对方法的线性、定量限、回收率、精密的、基质效应等进行了详细评价。此外,本研究将所建立的LC-MS/MS方法与化学发光免疫分析法(CLIA)和放射免疫分析法(RIA)进行了比较。通过对245份来自健康对照组、疾病组(胃泌素瘤及其他疾病患者)血清样本中的G17和G34进行分析,初步评估了两种亚型的胃泌素对胃泌素瘤的诊断效能。
 
本研究的主要结果
 
1. LC-MS/MS法的总运行时间为6分钟。G17和G34及其内标的典型色谱图如图1所示。
 
图1 血清样本G17和G34及其内标的典型色谱图
 
2. 本方法的回收率
 
LC-MS/MS法测定G17和G34的回收率结果如表1所示。
 
G17和G34的回收率分别为100.7%~109.1%和94.5%~98.3%。
 
表1 LC-MS/MS法测定G17和G34的回收率
 
3. 本方法的精密度
 
G17和G34的批内不精密度分别为4.0%~14.2%和4.4%~10.4%。
 
G17和G34总不精密度分别为5.2%~14.1%和4.6%~12.4%。
 
表2 LC-MS/MS法测定G17和G34的精密度
 
4. RIA、CLIA和LC-MS/MS方法比较
 
LC-MS/MS测定的胃泌素浓度与CLIA和RIA进行比较,相关系数(r)分别为0.87和0.84。CLIA与LC–MS/MS方法的斜率为1.48(95%CI:1.33~1.61),而RIA与LC–MS/MS方法的斜率为0.81(95%CI:0.69~0.96)。CLIA和RIA方法和LC–MS/MS方法的偏差均较大(图2)。
 
图2  RIA、CLIA及LC-MS/MS法测定血清G17和G34的方法学比对
 
5. 不同人群胃泌素水平分布
 
不同人群胃泌素水平分布如图3所示。
 
在GA(胃泌素瘤组)、MENS(除外胃泌素瘤的神经内分泌瘤组)、GC(胃癌组)和VBD(维生素B12缺乏组)中,胃泌素总和(G17+G34)[中位数(四分位数)]:分别为441.9(243.3~833.6)pg/mL、17.6(10.4~210.2)pg/mL、13.8(10.1~26.4)pg/mL和66.3(11.7-828.6)pg/mL。
 
G17浓度分别为266.0(5.9~634.4)pg/mL、5.0(5.0~47.4)pg/mL、5.0(5.0~5.8)pg/mL和30.7(5.0~132.2)pg/mL,而G34浓度分别为30.4(10.9~188.3)pg/mL、8.9(5.0~30.3)pg/mL、8.8(5.1~19.5)pg/mL和10.3(5.0~241.0)pg/mL。
 
图3 不同人群胃泌素水平的分布
 
6. 本方法测定胃泌素G17和G34对胃泌素瘤的预测作用
 
健康对照组、疾病组血清胃泌素的分布及胃泌素诊断界值的建立如图4所示。
 
将健康对照组、除外胃泌素瘤组、胃癌组及维生素B12缺乏组合并作为对照组,G17+G34、G17、G34的AUC分别为0.865(95%CI:0.766–0.964)、0.807(95%CI:0.694–0.919)和0.823(95%CI:0.694–0.952)。G17+G34的尤登指数最高时,浓度为227.5 pg/mL(临床特异性:90.8%,临床敏感性:81.3%);G34的尤登指数最高时,浓度为13.5 pg/mL(临床特异性:83.8%,临床敏感性:75%)。G17的尤登指数最高时,浓度为209.8 pg/mL(临床特异性:96.9%,临床敏感性:62.5%)。
 
图4 健康对照组、疾病组血清胃泌素的分布及胃泌素诊断界值的建立
 
结论
 
本研究在国内外首次建立可同时检测血清G17和G34的方法。该方法的建立有助于辅助诊断胃泌素升高的相关疾病。
 
实验室介绍
 
北京协和医院检验科生化与免疫专业组质谱实验室介绍:
 
北京协和医院检验科是国家临床重点专科建设项目,在2012年购入第一台液相色谱串联质谱仪,2018年后进入快速发展期,陆续购入两台高灵敏度液相色谱串联质谱仪,成立了质谱平台。
 
目前拥有液相色谱串联质谱仪(AB Sciex 4500MD、AB sciex 4000Qtrap、AB Sciex QTRAP 6500+、Waters Acquity UPLC I-Class xevo TQ-S、Waters Acquity UPLC I-Class xevo TQ-XS),电感耦合等离子体质谱仪(Thermo iCAP Q),离子色谱等仪器。质谱技术作为检验领域较为前沿的技术,正在从基础研究走向临床检测。目前拥有6名精通质谱技术的研究人员、技术人员、研究生及博士后,具有丰富的方法开发经验。
 
目前基于该平台,进行了大量的科研及临床转化工作。目前已在Clinical Chemistry and Laboratory Medicine、Journal of Chromatography B, Clinica Chimica Acta、中华检验医学等检验医学领域有影响力的期刊发表16篇质谱方法开发的文章(SCI 10篇),22篇基于质谱技术的应用类文章(SCI 15篇),同时将所建立的方法应用于临床,目前已在临床开展25羟基维生素D2&3、维生素A/E、极长链脂肪酸、血清碘及尿碘、儿茶酚胺及其代谢物、类固醇激素等四十余种检测项目,已测定临床样本10万余例。目前,平台在医院的大力扶持下正在积极引进新的质谱仪,开发更多新方法,年内拟临床检测项目增加到70项,并进一步扩展临床服务科室及疾病种类。
 
在方法建立和应用的同时,质谱平台积极开展与临床的密切沟通,参与多学科会诊,并利用协和医院内分泌科、神经科等科室的雄厚临床资源,探索复杂结果解释,参考区间建立,临床路径优化等一系列质谱临床应用中面临挑战的解决之路。积极参与仪器、设备、试剂的开发,申报多项专利,通过与业内质谱领域前沿团队交流、学习和合作,共同推进质谱在中国的临床应用。