质谱技术在肝脏疾病检测中的研究进展
2019-09-24 14:43 文章来源：检验医学网
作者：李波1，李伯安2
单位：1、解放军医学院，2、解放军第三○二医院临床检验医学中心
肝脏疾病是严重危害人类健康的疾病，其病因复杂多样，既包括感染、肿瘤等常见因素，也包括自身免疫性、先天性疾病等特殊因素。临床最常见的慢性肝病为乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染所致，在世界范围内分别有3.7亿和1.3亿患者；慢性肝炎通常缓慢进展为肝纤维化和肝硬化，最终可能发展为肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，肝细胞癌死亡率很高，据世卫组织报道，每年全世界死于HCC的患者约为600 000人，而其中一半死亡病例发生在中国[1]。除了病毒感染外，药物和毒物的损害，营养不良和嗜酒，以及代谢异常等因素也是肝脏疾病的主要原因。
慢性肝病的诊断对疾病的治疗和预后具有重要的意义，目前对肝炎病毒感染的诊断，通常采用免疫学或分子生物学技术检测病毒的特异性抗原、抗体或核酸片段，而肿瘤标志物及影像学技术对HCC的诊断也有广泛的临床应用。近几年，随着技术的发展和革新，质谱技术也开始广泛应用于各个医学诊断领域，如肿瘤标志物筛选、细菌鉴定、耐药分析以及病毒检测等，成为很多临床实验室的常规检测技术[2]。
一、质谱分析技术发展状况
虽然，世界上第一台质谱仪在20世纪早期就已研制成功，但直到20世纪80年代，随着基质辅助激光解析(Matrix–Assisted Laser Desorption/Ionization，MALDI)和电喷雾电离(Electrospray ionization，ESI)等"软电离"技术的发展才使得质谱技术在生物医学领域得到广泛的应用。随后，液质联用技术，如LC–MS/MS的出现，则极大地推动了质谱技术在医学检验领域的发展。目前应用较广泛的质谱技术包括表面增强激光解析电离飞行时间质谱(surface–enhanced laser desorption/ionization–time of flight，SELDI–TOF–MS)和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix–Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI–TOF–MS)等，它们是新型的蛋白质组学研究技术，具有高通量和高速度的优势，目前主要用于肿瘤及其他疾病标志物的筛选。但二者的灵敏度和重复性存在一定缺陷，严重制约了它们在临床检测中的应用。而且上述技术只能对目的蛋白或疾病标志物进行定性检测，无法反映疾病的严重程度并对疾病进行预后判断。近年新发展起来的包括核素标记定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)技术可对样品进行蛋白质绝对和相对定量研究，具有分离能力强，分析范围广的特点，但是，对样本要求高，样本处理过程复杂及高试剂成本是该技术的主要缺陷。基于气相色谱–质谱(Gas Chromatography–Mass Spectrometer，GC/MS)和液相色谱–质谱联用(Liquid Chromatography –Mass Spectrometry，LC/MS)技术是目前常用的检测方式，尤其是该技术在代谢组学中的研究价值受到学者的广泛关注，代谢组学的研究对象大都是相对分子质量1 000以内的内源性小分子物质，通常采用核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)，色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)等技术分离并检测人体尿液或血浆等生物样本中的代谢物谱图，再结合模式识别方法，可以判断出生物体的病理、生理状态，并找出与之相关的生物标志物。相比较蛋白质组研究，代谢物分子检测更加容易，并且种类少，更适合作为疾病的标志物。
二、质谱技术在病毒性肝炎检测中的应用
HBV及HCV感染严重威胁着人类健康，目前临床实验室主要采用化学发光和核酸扩增技术进行病毒抗原、抗体和核酸的检测。MassARRAY是基于MALDI–TOF–MS的核酸分析技术，已有学者将该技术用于HBV与HCV的血清分型，该方法的主要优势是快速、廉价。另外，该技术可以检测病毒的变异，区分野生株和突变株，指导临床用药，但缺点是只能用于HBV的B和C型[3]。
HBV突变可导致拉米夫定耐药，目前主要检测方法是测序，但耗时长，不适合大样本量的检测。Hong SP等采用MALDI–TOF–MS方法进行变异位点的检测，具有更高的灵敏度和特异性，并且可以对HBV感染患者抗病毒药物治疗效果进行监测[4]。另外，对HCV分型的MALDI–TOF–MS方法也有不少文献报道[5,6,7]。MALDI–TOF–MS技术也可用于其他抗病毒药物耐药的检测[8]。
三、质谱技术在肝纤维化及肝硬化检测中的应用
肝脏活组织检查是诊断肝纤维化的金标准，但该方法是有创性检查，患者依从性差，因此临床迫切需要寻找简单且易推广的无创性诊断指标用于评估肝纤维化。目前对肝纤维化的无创性诊断方法主要包括影像学和血清学指标，而质谱技术在寻找新的无创性诊断指标中发挥了很大的作用。Poon的研究组应用SELDI–TOF MS技术寻找与肝纤维化分期相关的蛋白指纹峰，并利用差异蛋白峰建立了神经网络(Artificial Neural Network，ANN)诊断模型，发现了5个蛋白峰(m/z为5905, 5928, 5948，3162，3267)与Ishak纤维化评分显著相关，ANN模型指数与纤维化评分呈显著相关性(r＝0.831)，并且其对肝硬化的预测正确率可到达89%，对Ishak>4的纤维化患者预测灵敏度可达100%[9]。Marfà等最近报道采用色谱和SELDI–TOF MS技术发现了一个5.9KDa的多肽具有肝脏早期纤维化的诊断价值，随后证实为纤维蛋白原α链的C末端片段[10]。
四、质谱技术在酒精性肝病检测中的应用
酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是由于长期大量饮酒所导致的肝脏疾病。ALD的诊断是基于综合临床特征的，包括明确的饮酒史、肝病临床证据和血清异常指标的支持。但常用的实验室检测指标在ALD诊断中的灵敏度和特异度均不能满足临床的需求，因此研究ALD的特异性诊断指标具有重要的现实意义。然而，由于酒精性肝病与其他类型肝病在患者机体生理变化上极其相似，所以寻找ALD特异性的标志物非常困难。Nomura的研究组早在2004年就采用质谱技术进行了这方面的探索，他们的思路是通过对酒精依赖症患者血清中的差异蛋白进行分析，试图找到具有诊断价值的ALD标志物，他们发现在慢性酒精依赖患者血清中纤维蛋白原aE片段和Apo AII以及色素上皮衍生因子(PEDF)都可能成为酒精依赖的特异性标志物[11,12]。另一个研究思路是通过对成人酒精摄入前后血清中蛋白质的变化来寻找酒精代谢的标志物，如Liangpunsakul等[13]采用MALDI–TOF–MS技术对16例志愿者饮酒前后的血清蛋白质谱进行比较，发现一个59 000的蛋白质在饮酒后发生了显著改变，经鉴定该差异蛋白为α–纤维蛋白原，并认为该蛋白可以作为ALD的特异性标志物。
另外，部分学者通过建立酒精依赖的动物模型，通过质谱检测发现了部分具有ALD诊断价值的蛋白质或代谢物分子，如Zhang L等采用蛋白质组学技术对酒精诱导的小鼠模型进行蛋白差异分析，他们提取了肝细胞的胞浆膜，并用双向技术和iTRAQ技术分别进行检测，结果共有15个不同的蛋白被检测出来，其中，角蛋白–8被在两种不同的方法中均被检测出有意义，他们认为该分子可能在酒精对肝脏的损害中发挥一定的作用[14,15,16]。
五、质谱技术在肝细胞癌检测中的应用
HCC是常见且致死率高的恶性肿瘤，目前临床使用的甲胎蛋白(alpha–fetal protein，AFP)一直是HCC诊断的重要指标，但AFP诊断HCC的灵敏度只有39%～65%，无法满足早期诊断和预后判断的要求，因此研究新的血清学标志物具有重要的意义。
2003年Poon的研究组采用SELDI–TOF–MS技术比较慢性肝病组(chronic liver disease，CLD)和HCC患者的血清蛋白指纹图谱，并根据差异蛋白建立了神经网络预测模型。他们发现m/z为8944和8811的蛋白峰在两组之间具有显著性表达差异，并且与肿瘤转移有关，ANN模型可到达90%的特异性和92%的灵敏度[17]。Liu C等采用MALDI–TOF–MS技术对60例HCC患者，36例其他肝病患者和46名性别年龄匹配的正常人的血清蛋白质谱进行比较，他们发现4471、8936、11670和13752 m/z的蛋白峰具有HCC鉴定的特异性，采用决策树建立诊断模型，其AUC可达到0.927[18]。Xiao等[19]采用超高效亲水性液相色谱与电喷雾四极杆飞行时间串联质谱联用法(Performance Liquid Chromatography–Quadrupole Time of Flight–Mass Spectrometry，UPLC–QTOF–MS)技术对HCC患者和肝硬化患者血清小分子代谢产物差异进行比较，最终，甘氨胆酸(glycocholicacid，GCA)，甘氨脱氧胆酸(glycodeoxy–cholic acid，GDCA)等代谢产物被发现在HCC组和肝硬化组有显著差异性，有望成为新的HCC诊断标志物。
六、展望
生物质谱技术具有高通量、快速等特点，因此在生物大分子研究领域得到了广泛应用，目前很多具备条件的临床实验室也开始引进质谱仪用于临床样本的检测[20]，例如MALDI–TOF–MS已成功进入临床微生物实验室，成为细菌鉴定领域突破性的技术。在肝病的诊断中，生物质谱技术具有很好地发展前景，通过质谱技术有可能发现一些灵敏度高和特异度好的肝病分子标志物，可极大地提高目前的肝病诊断水平。
参考文献
[1]Hernandez-GeaV, TuronF, BerzigottiA,et al. Management of small hepatocellular carcinoma in cirrhosis:Focus on portal hypertension[J]. World J Gastroenterol, 2013, 19(8):1193-1199.
[2]CoboF. Application of maldi-tof mass spectrometry in clinical virology:a review[J]. Open Virol J, 2013, 7:84-90.
[3]Ganova-Raeval, RamachandranS, HonischC. Robust hepatitis B virus genotyping by mass spectrometry[J]. J Clin Microbiol, 2010, 48(11):4161-4168.
[4]HongSP, KimNK, HwangSG,et al. Detection of hepatitis B virus YMDD variants using mass spectrometry analysis of oligonucleotide fragments [J]. J Hepatol,2004, 40(5):837-844.
[5]KimYJ, KimSO, ChungHJ, et al. Population genotyping of hepatitis C virus by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis of short DNA fragments[J].Clin Chem, 2005,51(7):1123-1131.
[6]IlinaEN, MalakhovaMV, GenerozovEV, et al. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of (mass spectrometry) for hepatitis C virus genotyping [J]. J Clin Microbiol, 2005, 43(6):2810-2815.
[7]OhHB, KimSO, ChaCH, et al. Identification of hepatitis C virus genotype 6 in Korean patients by analysis of 5′ untranslated region using a matrix assisted laser desorption/ionization time of flight- based assay, restriction fragment mass polymorphism [J]. J Med Virol, 2008, 80(10):1712-1719.
[8]ZürcherS, MooserC, LüthiAU, et al. Sensitive and rapid detection of ganciclovir resistance by PCR based MALDI-TOF analysis [J]. J Clin Virol ,2012, 54(4):359-363.
[9]PoonTC, HuiAY, ChanHL, et al. Prediction of liver fibrosis and cirrhosis in chronic hepatitis B infection by serum proteomic fingerprinting:A pilot study [J]. Clin Chem, 2005, 52(2):328-335.
[10]MarfàS, CrespoG, ReichenbachV, et al. Lack of a 5.9 kDa Peptide C-Terminal Fragment of Fibrinogen α Chain Precedes Fibrosis Progression in Patients with Liver Disease[J]. PLoS One, 2014, 9(10):e109254.
[11]NomuraF, TomonagaT, SogawaK, et al. Identification of novel and downregulated biomarkers for alcoholism by surface enhanced laser desorption/ionization-mass spectrometry [J]. Proteomics, 2004, 4(4):1187-1194.
[12]SogawaK, SatohM, KoderaY,et al. A search for novel markers of alcohol abuse using magnetic beads and MALDI-TOF/TOF mass spectrometry [J]. Proteomics Clin Appl, 2009, 3(7):821-828.
[13]LiangpunsakulS, LaiX, RinghamHN, et al. Serum proteomic profiles in subjects with heavy alcohol abuse [J].J Proteomics Bioinform, 2009,2(3):236-243.
[14]LiuSL, ChengCC, ChangCC,et al. Discovery of serum biomarkers of alcoholic fatty liver in a rodent model:C-reactive protein [J]. J Biomed Sci, 2011, 18(52):1-10.
[15]FreemanWM, SalzbergAC, GonzalesSW, et al. Classification of alcohol abuse by plasma protein biomarkers [J]. Biol Psychiatry. 2010, 68(3):219-222.
[16]ZhangL, JiaX, FengY,et al. Plasma membrane proteome analysis of the early effect of alcohol on liver:implications for alcoholic liver disease [J]. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2011,43(1):19-29.
[17]PoonTC, YipTT, ChanAT,et al. Comprehensive proteomic profiling identifies serum proteomic signatures for detection of hepatocellular carcinoma and its subtypes [J]. Clin Chem, 2003, 49(5):752-760.
[18]LiuC, ShenJ, PanC, et al. MALDI-TOF MS combined with magnetic beads for detecting serum protein biomarkers and establishment of boosting decision tree model for diagnosis of hepatocellular carcinoma[J]. Am J Clin Pathol, 2010, 134(2):235-241.
[19]XiaoJF, VargheseRS, ZhouB, et al. LC-MS based serum metabolomics for identification of hepatocellular carcinoma biomarkers in Egyptian cohort[J]. J Proteome Res, 2012,11(12):5914-5923.
[20]关明, 刘维薇, 吕元. 基于质谱的蛋白质组学诊断所面临的挑战[J]. 中华检验医学杂志,2009,32(2):130-133.
单位：1、解放军医学院，2、解放军第三○二医院临床检验医学中心
肝脏疾病是严重危害人类健康的疾病，其病因复杂多样，既包括感染、肿瘤等常见因素，也包括自身免疫性、先天性疾病等特殊因素。临床最常见的慢性肝病为乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染所致，在世界范围内分别有3.7亿和1.3亿患者；慢性肝炎通常缓慢进展为肝纤维化和肝硬化，最终可能发展为肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，肝细胞癌死亡率很高，据世卫组织报道，每年全世界死于HCC的患者约为600 000人，而其中一半死亡病例发生在中国[1]。除了病毒感染外，药物和毒物的损害，营养不良和嗜酒，以及代谢异常等因素也是肝脏疾病的主要原因。
慢性肝病的诊断对疾病的治疗和预后具有重要的意义，目前对肝炎病毒感染的诊断，通常采用免疫学或分子生物学技术检测病毒的特异性抗原、抗体或核酸片段，而肿瘤标志物及影像学技术对HCC的诊断也有广泛的临床应用。近几年，随着技术的发展和革新，质谱技术也开始广泛应用于各个医学诊断领域，如肿瘤标志物筛选、细菌鉴定、耐药分析以及病毒检测等，成为很多临床实验室的常规检测技术[2]。
一、质谱分析技术发展状况
虽然，世界上第一台质谱仪在20世纪早期就已研制成功，但直到20世纪80年代，随着基质辅助激光解析(Matrix–Assisted Laser Desorption/Ionization，MALDI)和电喷雾电离(Electrospray ionization，ESI)等"软电离"技术的发展才使得质谱技术在生物医学领域得到广泛的应用。随后，液质联用技术，如LC–MS/MS的出现，则极大地推动了质谱技术在医学检验领域的发展。目前应用较广泛的质谱技术包括表面增强激光解析电离飞行时间质谱(surface–enhanced laser desorption/ionization–time of flight，SELDI–TOF–MS)和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix–Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI–TOF–MS)等，它们是新型的蛋白质组学研究技术，具有高通量和高速度的优势，目前主要用于肿瘤及其他疾病标志物的筛选。但二者的灵敏度和重复性存在一定缺陷，严重制约了它们在临床检测中的应用。而且上述技术只能对目的蛋白或疾病标志物进行定性检测，无法反映疾病的严重程度并对疾病进行预后判断。近年新发展起来的包括核素标记定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)技术可对样品进行蛋白质绝对和相对定量研究，具有分离能力强，分析范围广的特点，但是，对样本要求高，样本处理过程复杂及高试剂成本是该技术的主要缺陷。基于气相色谱–质谱(Gas Chromatography–Mass Spectrometer，GC/MS)和液相色谱–质谱联用(Liquid Chromatography –Mass Spectrometry，LC/MS)技术是目前常用的检测方式，尤其是该技术在代谢组学中的研究价值受到学者的广泛关注，代谢组学的研究对象大都是相对分子质量1 000以内的内源性小分子物质，通常采用核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)，色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)等技术分离并检测人体尿液或血浆等生物样本中的代谢物谱图，再结合模式识别方法，可以判断出生物体的病理、生理状态，并找出与之相关的生物标志物。相比较蛋白质组研究，代谢物分子检测更加容易，并且种类少，更适合作为疾病的标志物。
二、质谱技术在病毒性肝炎检测中的应用
HBV及HCV感染严重威胁着人类健康，目前临床实验室主要采用化学发光和核酸扩增技术进行病毒抗原、抗体和核酸的检测。MassARRAY是基于MALDI–TOF–MS的核酸分析技术，已有学者将该技术用于HBV与HCV的血清分型，该方法的主要优势是快速、廉价。另外，该技术可以检测病毒的变异，区分野生株和突变株，指导临床用药，但缺点是只能用于HBV的B和C型[3]。
HBV突变可导致拉米夫定耐药，目前主要检测方法是测序，但耗时长，不适合大样本量的检测。Hong SP等采用MALDI–TOF–MS方法进行变异位点的检测，具有更高的灵敏度和特异性，并且可以对HBV感染患者抗病毒药物治疗效果进行监测[4]。另外，对HCV分型的MALDI–TOF–MS方法也有不少文献报道[5,6,7]。MALDI–TOF–MS技术也可用于其他抗病毒药物耐药的检测[8]。
三、质谱技术在肝纤维化及肝硬化检测中的应用
肝脏活组织检查是诊断肝纤维化的金标准，但该方法是有创性检查，患者依从性差，因此临床迫切需要寻找简单且易推广的无创性诊断指标用于评估肝纤维化。目前对肝纤维化的无创性诊断方法主要包括影像学和血清学指标，而质谱技术在寻找新的无创性诊断指标中发挥了很大的作用。Poon的研究组应用SELDI–TOF MS技术寻找与肝纤维化分期相关的蛋白指纹峰，并利用差异蛋白峰建立了神经网络(Artificial Neural Network，ANN)诊断模型，发现了5个蛋白峰(m/z为5905, 5928, 5948，3162，3267)与Ishak纤维化评分显著相关，ANN模型指数与纤维化评分呈显著相关性(r＝0.831)，并且其对肝硬化的预测正确率可到达89%，对Ishak>4的纤维化患者预测灵敏度可达100%[9]。Marfà等最近报道采用色谱和SELDI–TOF MS技术发现了一个5.9KDa的多肽具有肝脏早期纤维化的诊断价值，随后证实为纤维蛋白原α链的C末端片段[10]。
四、质谱技术在酒精性肝病检测中的应用
酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是由于长期大量饮酒所导致的肝脏疾病。ALD的诊断是基于综合临床特征的，包括明确的饮酒史、肝病临床证据和血清异常指标的支持。但常用的实验室检测指标在ALD诊断中的灵敏度和特异度均不能满足临床的需求，因此研究ALD的特异性诊断指标具有重要的现实意义。然而，由于酒精性肝病与其他类型肝病在患者机体生理变化上极其相似，所以寻找ALD特异性的标志物非常困难。Nomura的研究组早在2004年就采用质谱技术进行了这方面的探索，他们的思路是通过对酒精依赖症患者血清中的差异蛋白进行分析，试图找到具有诊断价值的ALD标志物，他们发现在慢性酒精依赖患者血清中纤维蛋白原aE片段和Apo AII以及色素上皮衍生因子(PEDF)都可能成为酒精依赖的特异性标志物[11,12]。另一个研究思路是通过对成人酒精摄入前后血清中蛋白质的变化来寻找酒精代谢的标志物，如Liangpunsakul等[13]采用MALDI–TOF–MS技术对16例志愿者饮酒前后的血清蛋白质谱进行比较，发现一个59 000的蛋白质在饮酒后发生了显著改变，经鉴定该差异蛋白为α–纤维蛋白原，并认为该蛋白可以作为ALD的特异性标志物。
另外，部分学者通过建立酒精依赖的动物模型，通过质谱检测发现了部分具有ALD诊断价值的蛋白质或代谢物分子，如Zhang L等采用蛋白质组学技术对酒精诱导的小鼠模型进行蛋白差异分析，他们提取了肝细胞的胞浆膜，并用双向技术和iTRAQ技术分别进行检测，结果共有15个不同的蛋白被检测出来，其中，角蛋白–8被在两种不同的方法中均被检测出有意义，他们认为该分子可能在酒精对肝脏的损害中发挥一定的作用[14,15,16]。
五、质谱技术在肝细胞癌检测中的应用
HCC是常见且致死率高的恶性肿瘤，目前临床使用的甲胎蛋白(alpha–fetal protein，AFP)一直是HCC诊断的重要指标，但AFP诊断HCC的灵敏度只有39%～65%，无法满足早期诊断和预后判断的要求，因此研究新的血清学标志物具有重要的意义。
2003年Poon的研究组采用SELDI–TOF–MS技术比较慢性肝病组(chronic liver disease，CLD)和HCC患者的血清蛋白指纹图谱，并根据差异蛋白建立了神经网络预测模型。他们发现m/z为8944和8811的蛋白峰在两组之间具有显著性表达差异，并且与肿瘤转移有关，ANN模型可到达90%的特异性和92%的灵敏度[17]。Liu C等采用MALDI–TOF–MS技术对60例HCC患者，36例其他肝病患者和46名性别年龄匹配的正常人的血清蛋白质谱进行比较，他们发现4471、8936、11670和13752 m/z的蛋白峰具有HCC鉴定的特异性，采用决策树建立诊断模型，其AUC可达到0.927[18]。Xiao等[19]采用超高效亲水性液相色谱与电喷雾四极杆飞行时间串联质谱联用法(Performance Liquid Chromatography–Quadrupole Time of Flight–Mass Spectrometry，UPLC–QTOF–MS)技术对HCC患者和肝硬化患者血清小分子代谢产物差异进行比较，最终，甘氨胆酸(glycocholicacid，GCA)，甘氨脱氧胆酸(glycodeoxy–cholic acid，GDCA)等代谢产物被发现在HCC组和肝硬化组有显著差异性，有望成为新的HCC诊断标志物。
六、展望
生物质谱技术具有高通量、快速等特点，因此在生物大分子研究领域得到了广泛应用，目前很多具备条件的临床实验室也开始引进质谱仪用于临床样本的检测[20]，例如MALDI–TOF–MS已成功进入临床微生物实验室，成为细菌鉴定领域突破性的技术。在肝病的诊断中，生物质谱技术具有很好地发展前景，通过质谱技术有可能发现一些灵敏度高和特异度好的肝病分子标志物，可极大地提高目前的肝病诊断水平。
参考文献
[1]Hernandez-GeaV, TuronF, BerzigottiA,et al. Management of small hepatocellular carcinoma in cirrhosis:Focus on portal hypertension[J]. World J Gastroenterol, 2013, 19(8):1193-1199.
[2]CoboF. Application of maldi-tof mass spectrometry in clinical virology:a review[J]. Open Virol J, 2013, 7:84-90.
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[5]KimYJ, KimSO, ChungHJ, et al. Population genotyping of hepatitis C virus by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis of short DNA fragments[J].Clin Chem, 2005,51(7):1123-1131.
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[7]OhHB, KimSO, ChaCH, et al. Identification of hepatitis C virus genotype 6 in Korean patients by analysis of 5′ untranslated region using a matrix assisted laser desorption/ionization time of flight- based assay, restriction fragment mass polymorphism [J]. J Med Virol, 2008, 80(10):1712-1719.
[8]ZürcherS, MooserC, LüthiAU, et al. Sensitive and rapid detection of ganciclovir resistance by PCR based MALDI-TOF analysis [J]. J Clin Virol ,2012, 54(4):359-363.
[9]PoonTC, HuiAY, ChanHL, et al. Prediction of liver fibrosis and cirrhosis in chronic hepatitis B infection by serum proteomic fingerprinting:A pilot study [J]. Clin Chem, 2005, 52(2):328-335.
[10]MarfàS, CrespoG, ReichenbachV, et al. Lack of a 5.9 kDa Peptide C-Terminal Fragment of Fibrinogen α Chain Precedes Fibrosis Progression in Patients with Liver Disease[J]. PLoS One, 2014, 9(10):e109254.
[11]NomuraF, TomonagaT, SogawaK, et al. Identification of novel and downregulated biomarkers for alcoholism by surface enhanced laser desorption/ionization-mass spectrometry [J]. Proteomics, 2004, 4(4):1187-1194.
[12]SogawaK, SatohM, KoderaY,et al. A search for novel markers of alcohol abuse using magnetic beads and MALDI-TOF/TOF mass spectrometry [J]. Proteomics Clin Appl, 2009, 3(7):821-828.
[13]LiangpunsakulS, LaiX, RinghamHN, et al. Serum proteomic profiles in subjects with heavy alcohol abuse [J].J Proteomics Bioinform, 2009,2(3):236-243.
[14]LiuSL, ChengCC, ChangCC,et al. Discovery of serum biomarkers of alcoholic fatty liver in a rodent model:C-reactive protein [J]. J Biomed Sci, 2011, 18(52):1-10.
[15]FreemanWM, SalzbergAC, GonzalesSW, et al. Classification of alcohol abuse by plasma protein biomarkers [J]. Biol Psychiatry. 2010, 68(3):219-222.
[16]ZhangL, JiaX, FengY,et al. Plasma membrane proteome analysis of the early effect of alcohol on liver:implications for alcoholic liver disease [J]. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2011,43(1):19-29.
[17]PoonTC, YipTT, ChanAT,et al. Comprehensive proteomic profiling identifies serum proteomic signatures for detection of hepatocellular carcinoma and its subtypes [J]. Clin Chem, 2003, 49(5):752-760.
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[19]XiaoJF, VargheseRS, ZhouB, et al. LC-MS based serum metabolomics for identification of hepatocellular carcinoma biomarkers in Egyptian cohort[J]. J Proteome Res, 2012,11(12):5914-5923.
[20]关明, 刘维薇, 吕元. 基于质谱的蛋白质组学诊断所面临的挑战[J]. 中华检验医学杂志,2009,32(2):130-133.