作者：邓秋平

单位：成都市锦江区妇幼保健院检验科


维生素是维持机体正常生理功能所必需的一类有机物质，分为脂溶性维生素与水溶性维生素两大类。人体所需的必需维生素共13种，即维生素 A、B、C、D、E、K、H、P、PP、M、T、U 以及类维生素。类维生素与正常的维生素结构类似，在体内可以代谢转化为维生素。


大多数维生素不在体内合成，常需通过食物摄取。虽然人体每日仅需毫克或微克量的维生素，但摄入量不足仍然会引起维生素缺乏症，对机体造成损伤。


维生素缺乏在临床上较为常见，总结原因如下：①食物中摄入不足；②吸收利用率降低；③维生素需求量相对增高；④抗菌药物的不合理应用等。


不同方法检测维生素的比较


维生素的检测方法有多种，主要有放射免疫法、化学发光法、高效液相色谱法和液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）等。

不同的维生素具有不同的分子结构、化学性质和上千倍差异的生理浓度范围，准确检测维生素系列从样品处理到检测方法都存在不同的挑战。例如维生素D检测，化学发光法虽然可以实现快速和高通量，但是其特异性低，易与自身抗体、特异性抗体发生交叉反应。而且不同品牌的试剂对目标化合物的捕获效率可能存在差异，不同平台的检测结果可比性差。

对于缺乏维生素及婴幼儿人群，免疫学方法检测经常会出现假阳性或假阴性。对于正常人群健康检测，免疫法因为自动化程度高经常作为首选，但目前传统的免疫学方法检测25-OHD无法区分亚型维生素D2、D3及3-epi 25（OH）D3。此外，由于维生素具有不同的化学结构，免疫方法学需要不同的抗体及方法。


而液相色谱-串联质谱技术以其样品量小，快速、高灵敏度、高特异性及可以同时检测多种化合物等优点逐渐被临床检验的专家所关注。


维生素项目利用LC-MS/MS串联质谱技术检测过程描述 


样品首先进入液相系统，经色谱柱分离、纯化和浓缩，被导入质谱系统。在质谱系统的离子源内电离后进入三重四极杆质量分析器，根据离子的质荷比（m/z）进行分离，以多反应监测模式（MRM）采集数据，Q1用于筛选特定的母离子，选择Q1后，母离子被导入碰撞池Q2内发生裂解，母离子碎片化之后，只有特定的子离子才能通过Q3，进入检测器，记录检测样品中各分析物及内标的色谱图和峰面积。


通过计算样品中各维生素与相应内标峰面积的比值，以校准品的靶值浓度为横坐标，以校准品与相应内标峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线并拟合线性方程，将样品（质控品、血清样品）中各维生素与相应内标峰面积比代入标准曲线方程，即可计算出样品中各维生素浓度。


LC-MS/MS法检测维生素的难点与挑战


一次样品处理及检测多种脂溶性维生素测定的难点在于：各待测物在人体血清中的含量差别较大，如人体血清中维生素A、E的含量高达μg/ml级别，维生素D的含量为ng/ml级别，而维生素K的含量小于2 ng/ml，普通检测器很难满足同时对这几种化合物在线性范围进行检测并满足其高灵敏度的要求；且各脂溶性维生素的极性差别较大，维生素A 的极性相对较强，在液相质谱柱上容易被洗脱；维生素E和 K的极性较弱，较难被洗脱。此外，不同人体血清中的内源性物质对维生素E的检测存在严重的基质效应，因此检测过程中需要使用同位素内标。


先进的SPE或SLE或萃取样品处理技术可以实现LC-MS/MS法同时检测维生素A、D、E、K，其优势在于：前处理方法采用96孔板方法，简化了实验步骤、大大缩短了前处理时间，提高了检测通量；采用梯度洗脱条件，在缩短分析时间的同时获得了较好的去介质及分离效果，一次10μl进样可同时得到VA、25-OHD2、25-OHD3、VE和VK的检测结果；同时在前处理过程中添加同位素内标后，消除了不同基质样本中内源性物质对检测物的影响，大大提高了检测结果的准确性。


维生素B族化合物测定的难点在于：维生素B化合物大多以离子形态存在于水溶液中，在反相色谱柱上的保留能力较差，因此需要选择合适的色谱柱使其得到较好的保留。


值得注意的是，PLP在血清中与血清白蛋白有很强的结合，对样本进行强酸性处理及足够的孵育时间是前处理的关键步骤。


而对于MMA检测，我们在实际样本检测中发现，其同分异构体丁二酸（SA）的含量远远高于MMA的含量，质谱碎裂行为一致，因此色谱方法学需要保证两者在液相上的分离以避免假阳性。 


近年来随着液相色谱技术的发展，对于极性强的化合物，流动相中不再需要添加对色谱柱柱效及泵损害较大的离子对试剂，仅采用常规的流动相体系即可同时检测血清中的B族维生素；采用了同位素内标后，消除了不同基质样本中内源性物质对维生素B族化合物检测的影响，保证了检测结果的准确性。


展望


随着检测技术的发展，维生素检测广泛应用于儿童生长、健康管理、运动恢复、疾病诊断等方面。虽然常规的免疫学方法因其单项成本低、自动化程度高等优势，一度成为单一维生素指标的临床检测的首选方法，但是随着精准医疗时代的到来，临床质谱技术具有高灵敏度、高特异及准确性等特点，可通过微量样品同时检测多种相关的化合物及相关代谢产物，正逐步发展成维生素临床检测的首选方法。


【参考文献】

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